摘要在以嗜热子囊茵生产过氧化氢酶的摇瓶发酵研究中，获得了适合工业化生产的碳源，即以269／L的糊化玉米淀粉和1％(v／v)乙醇为混合碳源，过氧化氢酶的酶活达到了1996 u／n儿，比优化前提高了25％。在此基础上，重点研究了发酵罐上的主要影响因素溶解氧对发酵的影响，通过分段控制搅拌转速，在52h将搅拌转速从200r／rnin提高到350r／min，过氧化氢酶最高酶活达到4505 u／mL，与不使用控制溶氧水平策略相比，酶活力提高了2．4倍。此外，还考察了该酶去除过氧化氢的效率，并在实际纺织生产中进行了应用实验，取得了良好的效果。
过氧化氢酶(ECl．11．1．6 catalaSe，简称凹汀)是一种能够高效催化分解过氧化氢的酶，几乎存在于所有好氧生物的生物体内，具有清除自由基，保护细胞免受超氧自由基损害等保护生物机体的作用。广泛用于食品消毒、临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业。近年来，随着绿色环保意识与要求的不断加强，在染整工艺中利用酶替代传统的强碱高温工艺对棉织物进行前处理已成为大势所趋。Q盯在棉织物前处理过程中的主要作用是去除织物漂白废液中残余的H202，以免给后续染色工序带来问题【1]。应用CAT实现漂染同浴，不仅能节省大量的水、电、汽的消耗，提高生产效率，还能减少废水的排放，有利于环保。但是，现有商品CAT在高温和强碱性环境下易失活，限制了CAT在染整工艺中的应用。
CAT来源丰富，几乎存在于所有好氧生物中。但来自动物脏器以及一些微生物(如溶壁微球菌、球形红假单孢菌、大肠杆菌、粗糙脉孢霉、微紫青霉、黑曲霉)的CAT，均不能忍受接近沸点的高温和pH大于10的强碱性[3]。近20年来，关于嗜热菌H’5]、嗜碱菌[6]或嗜热嗜碱菌[7]产生凹汀的报道陆续出现，特别是嗜热子囊菌所产的CAT是迄今为止已报道过的热、碱稳定性最好的CAT【8]，为开发耐热耐碱的G盯提供了可能。
本研究室在前期研究中，筛选得到了一株金黄色嗜热子囊菌WSH 03—01，该菌株发酵生产的CAT酶活较高，而且对热和碱的稳定性都较好，在纺织清洁生产中具有良好的应用潜力。为了适应工业化生产的条件，本文在上述实验室研究的基础上，采用工业级碳源替代原先的试剂级碳源，在7L发酵罐上考察了其发酵生产已盯的可行性，在此基础上，着重考察了溶解氧对发酵过程的影响，并验证了发酵生产所得的Q盯对过氧化氢的去除效率，最后，在染整清洁生产中进行了应用试验，取得了较好的效果。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1 茵种
金黄色嗜热子囊菌
1．1．2材料与仪器
全自动发酵罐KFT-7 L(Korea Fennentor CO．，
Ltd，韩国)。
1．1．3培养基
斜面培养基mA(每支茄式瓶)：6度麦汁30mL，琼脂19，pH6．0。
种子培养基(g／L)：玉米淀粉15，蛋白胨4，酵母膏4，K2Ⅷ’04 1，Na2HP04 1，MgS04。7H20 5，pH6．8。
基础发酵培养基(g／L)：玉米淀粉26，蛋白胨10，(NH)2S04 2，K2}Ⅱ氇5，KH2P04·3H20 3，Mg鼢·7H20 2，微量元素液2 mL，10rnL乙醇，pH7．O。
微量元素液(∥L)：FeQ H5 07·mO 6，Cacl2·2H20 4，Z蜘4‘7H20 2，MnCl2‘4H20 0．1，K1 0．1，(m)6M07Q4·4H20 0．1，C。C12·6H20 0．1，H38030．1，NaCl 5。
1．2实验方法
1．2．1培养方法
1)摇瓶培养：将成熟的孢子接种到P【)A斜面上，45℃培养13～16d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬液接种于种子培养基中(培养基中孢子浓度为104个／mL)，45℃摇床培养52h。吸取种子培养液，按10％的接种量接种于基础发酵培养基中(500mL摇瓶中装100 mL培养基)，45℃摇床培养84 h。每项实验均设三个平行样。
2)发酵罐培养：将成熟的孢子接种到PDA斜面上，45℃下培养13～16d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬液接种于种子培养基中(培养基中孢子浓度为104个／mL)，45℃培养52h，再以7％的接种量接入发酵罐，从48h开始流加乙醇直至发酵结束，通气量1：1，200r／nlin，52h后调整为350r／nlin。
1．2．2发酵液挥发量的校正
发酵过程在高温下进行且周期较长，培养基中水分的挥发对实验结果的准确性会有较大影响，因此在发酵结束后采用称重补水法进行校正。将接种后的摇瓶用电子天平(0．019)记录初始质量，发酵结束后，分别将去离子水补人相应摇瓶至初始值。恢复质量后的发酵液再用于发酵液各项参数的分析测定。
由于发酵罐发酵体积较大，故发酵结束后未对发酵液挥发量进行校正。
1．2．3生物量测定
取50 mL发酵液进行真空抽滤，收集湿菌体，用蒸馏水洗涤2次后，置105℃下恒温干燥至恒重，用称重法测定生物量。
1．2．4过氧化氢酶活性测定
采用分光光度法在25℃下测定[10|。反应总体积为3 mL，含0．1n1L酶液和2．9mL含有10 mmol／L H202的50 n蚰ol／L的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠缓冲液(pH 7．0)。过氧化氢的分解速率用752型紫外一可见光分光光度计在240 m下测定。酶活定义为：在上述条件下，每分钟分解1肛m01 H202所需的酶量为一个酶活单位。
1．2．5 还原糖的测定：3，5一二硝基水杨酸比色法[11|。
1．2．6总糖的测定：蒽酮比色法[12】。
1．2．7染整清洁生产实际应用工业化试验
试验地点：无锡天时针织有限责任公司
试验样本：150kg纯棉布
传统工艺：漂白(过氧化氢)一冷水洗(溢流，10rnin)一热水洗(98℃，10 H1in)一冷水洗(5～10 rnjn)1～2次一染色。
酶法工艺：漂白(过氧化氢)一冷水洗(溢流，10rnjn)一酶处理(10L酶液，约1．5万u／mL，20 rnin，60℃)一热水洗(98℃，10删n)一染色。
色差测试：采用上海精密仪器厂生产的WSeC型测色色差计测定
2结果与讨论
2．1发酵工艺碳源的确定
前期研究表明，T．n乱m咒￡inc“s WSH 03—01对单糖和双糖的利用较差，当以葡萄糖为碳源时，浓度超过4 g／L后产Q盯的浓度迅速降低，而当浓度达到20 g／L时，发酵终了时Q盯酶活极低(<10 u／mL)，且发酵液的pH均降至3以下[9J。与此相反，该微生物菌株以209／L英国胶(糊精的一种)作为碳源时，却表现出良好的生长与产酶特性【9]。但是英国胶没有工业化产品，不适合作为大规模生产的原料。因此，需要选择一种适合于工业化的相近原料进行替代。
研究中选择的碳源是常用的工业原料，在摇瓶条件下比较了不同碳源对产酶的影响。结果如图1，两种型号的糊精TF．AC0500和糊精SPO．M0350(由天津顶峰变性淀粉生产有限公司提供)的DE值(葡萄糖当量，DE值越高表示水解程度越高)与英国胶相似，且菌体生长无较大差异，但是其产酶效果与英国胶(209／L)相比降低了40％左右。麦芽糊精为碳源时菌体干重(DICW)比对照有提高，但对产酶作用不明显。使用液化后玉米淀粉作为碳源时，酶活比对照下降了80％。相比之下，以糊化后的玉米淀粉为碳源时有利于菌体的生长，比英国胶和麦芽糊精的酶活分别提高了6％和50％。
从以上结果，可以认为溶解氧在T发酵产CAT中具有较为重要的影响。根据该微生物发酵产酶的周期特点，我们采用分段控制搅拌转速的策略，以获得不同的溶氧水平，即发酵前期搅拌转速控制在200r／min，52h后提高到350r／min，在此条件下考察其发酵过程，结果如图3所示。可以看出，发酵前52h菌体生长较快，转速提高后菌体的生长速度有所降低，在74h达到最大值10．969／L；而T．口乱m，z￡缸c“s WSH 03—01合成Q盯的速度在经过53—63h的平稳期之后明显加快，112h时CAT酶活力达到最大4505 u／mL，与不使用分段控制搅拌转速发酵罐最高酶活1851 u／mL相比，酶生产率提高了2．4倍，DCW也从9．96∥L提高到了11．29／L，这一结果表明，分阶段控制溶解氧在提高酶活与促进菌体生长方面具有明显效果。
此外，对发酵过程中的pH变化考察可以发现，在45h前pH一直呈现下降的趋势，这是由于碳源分解形成的酸性中间产物造成的，这也表明菌体处于旺盛的生长期。45h后pH开始回升，同时a盯合成速率也增加，pH的回升正好与产酶进入高峰期相对应，掌握这一特征现象在实际工业生产中是十分有利的。
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