巴豆为大戟科植物巴豆(CrotontigliumL．)的干燥成熟种子，主产于我国西南及福建、湖北、湖南、广东、广西等地。性辛，热;有大毒，归胃、大肠经。内服泻下寒积、逐水消肿、祛痰利咽，外用蚀疮，可用于恶疮疥癣［1］。巴豆含脂肪油、蛋白质和生物碱等物质，其中巴豆总生物碱具显著的生理活性，具有抗癌抗肿瘤作用，如能诱导人肝癌SMMC-7721细胞、人胃腺癌SGC-7901细胞等肿瘤细胞凋亡［2－3］。但目前尚未见巴豆中生物碱具体化学成分组成的相关报道，亦无有关巴豆中总生物碱含量测定方面的文献。已有研究表明木兰花碱具有抗炎、降压、抗生育等作用，可抑制α-葡萄糖苷酶活性［4］、抑制HERG钾通道蛋白的表达等［5］。本试验首次从巴豆中分离得到木兰花碱，并以木兰花碱为对照品，采用酸性染料比色法，首次建立了巴豆中总生物碱含量测定的方法，并比较了不同产地巴豆中总生物碱的含量，为巴豆药材的质量评价及巴豆总生物碱的开发利用提供依据。

1·仪器与试剂

Thermo紫外-可见分光光度计、SsrtoriusBSA224S-CW万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)、SsrtoriusCP225D十万分之一电子分析天平(广州市正一科技有限公司)。10批巴豆药材分别来源于四川、广西、云南3个主产区(详见表2)，经广州中医药大学赖小平研究员鉴定为大戟科植物巴豆CrotontigliumL．的果实。木兰花碱对照品(广州中医药大学新药开发研究中心提供，经HPLC法测定质量分数＞98%)。试验试剂均为分析纯，水为超纯水。

2·方法与结果

2．1溶液的制备

2．1．1对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的木兰花碱对照品4．91mg，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密吸取5mL，置50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.0491mg·mL－1的对照品溶液。

2．1．2供试品溶液的制备取干燥巴豆细粉2.5g，加乙醚索氏提取3h去油后，药渣用10倍量40%(体积分数)乙醇回流提取2次，每次40min，滤过，合并提取液，回收溶剂，定容至100mL容量瓶中，即得。

2．2酸性染料比色法条件的选择

2．2．1测定波长的选择精密吸取木兰花碱对照品溶液2．8mL及供试品溶液1．0mL，分别加入pH6．0磷酸缓冲液至8mL。分别加入溴麝香草酚蓝溶液3．5mL，三氯甲烷8mL，充分振摇3min后，静止40min后分取三氯甲烷液。另取磷酸缓冲液8mL，同法操作得三氯甲烷液，作为空白溶液，分别在200～600nm进行扫描。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在420nm处均有稳定的最大吸收，空白溶液则无吸收，如图1所示，故选择420nm为测定波长。

2．2．2酸性染料用量的选择精密吸取木兰花碱对照品溶液2mL，共6份，分别置于不同的分液漏斗中，加入pH6．0磷酸缓冲液至8mL，分别加入配制好的溴麝香草酚蓝溶液2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5mL，其余按“2．2．1”项下同法操作。结果表明当溴麝香草酚蓝溶液加入量为3．5mL时吸光度最大，故选择溴麝香草酚蓝溶液的加入量为3．5mL。

2．2．3缓冲液pH的选择分别配制pH值为5．6、5．8、6．0、6．2、6．5、6．8的磷酸缓冲盐，精密吸取巴豆供试品溶液0．5mL、木兰花碱对照品溶液2mL，共6份，其余按照“2．2．1”项下操作，分别在420nm处测定吸光度。结果表明供试品和对照品溶液均在pH6．0缓冲液中吸光度值最大，故选用pH值为6.0的缓冲液。

2．2．4缓冲液用量的选择精密量取木兰花碱对照品溶液2mL，共7份，分别置于7个分液漏斗中，分别加入pH6．0磷酸缓冲液至6、7、8、9、10、11、12mL，再加入配制好的溴麝香草酚蓝溶液3．5mL，其余按“2．2．1”项下操作，结果表明加缓冲液至8～10mL时吸光度无明显变化，为节省溶剂，选择加入缓冲液至8mL。

2．3方法学考察

2．3．1标准曲线的制备精密吸取木兰花碱对照品液0．5、1．0、1．4、1．7、2．0、2．3、2．7、3．0mL，分别置于8个分液漏斗中，加pH值为6．0的磷酸缓冲液至8mL，其余操作按“2．2．1”项下进行。以对照品质量(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程:Y=4．6291X－0．0098(r=0.9995)，结果表明木兰花碱在0．0246～0．1473mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2．3．2精密度试验分别精密吸取已显色好的木兰花碱对照品溶液2mL，依法测定6次，吸光度的RSD值为0．61%，表明仪器精密度良好。

2．3．3稳定性试验精密吸取同一供试品(批号:20101122)溶液2mL，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h依法测定吸光值，结果RSD为0．76%，表明供试品溶液在3h内基本稳定。

2．3．4重复性试验精密称取同一批样品(批号:20101122)6份，各约2．5g，分别按“2．1．2”项下方法制备供试品溶液，按“2．2．1”项下方法测定吸光度，结果总生物碱平均质量分数为0．32%，RSD值为0．92%。

2．3．5加样回收率试验精密称取已知含量的同一批巴豆粉末(批号:20101122)约0．5g，精密称定，共6份，分别加入木兰花碱对照品溶液适量，分别按“2．1．2”项下方法制备供试品溶液。分别精确吸取2．5mL，各加入pH6．0磷酸缓冲液6mL，其余按“2．2．1”项下方法操作，在420nm处测定吸光度，结果见表1。平均回收率为99．0%，RSD为2．75%。