栀子(Gardenia jasmonoides L.)属于茜草科植物，作为传统中草药在我国应用于疾病治疗已经有1 600多年的历史. 栀子果实中栀子苷的主要化学成分为京尼平苷(Geniposide)，京尼平苷经β-葡萄糖苷酶水解得到京尼平(Genipin)，二者在生物医学材料和材料工程[1, 2]、食品和色素添加剂[3]、中药保肝利胆[4, 5]、抗癌和抗炎症[6, 7]、生物检测[8, 9]以及农业生产增产[10, 11]等方面有着广泛的应用.
我国是养蚕大国，2007年全国桑园面积为9.607×107 m2，蚕茧产量7.927×108 kg[12]. 我国现有蚕丝出口可以占到世界蚕丝出口总量的70%，但在独立开发应用上只占0.5%，如何增强对蚕丝的深加工、提高蚕丝的综合利用价值，成为困扰我国丝绸工业和广大蚕农的一个重大问题. 此外，由于知识的普及和安全意识的增强，人们越来越意识到化学合成染料对人体造成的伤害和和对环境造成的污染，这在一定程度上也限制了丝绸产业的发展. 京尼平具有低的细胞毒性[13]，对胶原、明胶等具有交联作用，可应用于生物医学材料和药品包装等方面[2]，目前关于京尼平与蛋白质交联反应的机理还没有统一的认识. 现有研究表明，在一定条件下，京尼平与氨基酸能够进行呈色反应生成栀子蓝色素[14]. 因此，本文以蚕丝和制备的丝素蛋白为材料，对京尼平的染色作用和影响因素进行了探讨，对交联反应颜色产物的稳定性进行了分析，并通过紫外可见光和荧光光谱测定的方法，初步考察了京尼平与丝素蛋白交联颜色反应的机理.
1 材料与方法
1.1 材料
蚕丝购于成都市场，京尼平购自上海沪云医药科技公司(相对分子质量226，纯度≥98%)，配制缓冲液试剂及其他相关试剂均为国产分析纯.
称取蚕丝(除去蚕茧等杂质) 1 g置于20 mL 0.05 mol/ L NaHCO3溶液中，在沸水浴中煮3~4 min，重复2~3次以完全去除丝胶，清水洗净后烘干. 再于80 ℃水浴条件下于500 g/L CaCl2中溶解，自然冷却后透析过夜，AgNO3检测合格后，用Bradford法测定丝素蛋白溶液浓度.
1.2 实验方法
剪成小段的蚕丝，放入4支试管中，分别加入2 mL 浓度分别为1、2 mg/ mL的京尼平水溶液(pH 5.5) 和1、2 mg/ mL京尼平的PBS (pH 8.0)溶液，密闭后于80 ℃水浴条件下浸泡反应2 h，待清水冲洗后，晾干，拍照.
3 mL丝素蛋白水溶液(1 mg/ mL)中，加入450 μL的0.1%京尼平溶液，于35 ℃水浴放置，反应不同时间后，以相同浓度的丝素蛋白溶液为参比，对反应溶液进行吸收光谱扫描200~800 nm，找出最大特征光吸收值.
1.3 温度、酸碱度等因素对反应的影响
分别取1 mg/ mL丝素蛋白水溶液3 mL置于两支试管(试管标号：1、3)中和PBS (pH 8.0)溶液3 mL置于两支试管(试管标号：2、4)中，加入450 μL的1 mg/ mL京尼平溶液后，将1、2试管置于80 ℃水浴中2 h，3、4于35 ℃水浴中反应48 h，测定吸收光谱，并进行拍照. 考查酸碱度的影响时，采用不同的缓冲溶液，pH 3 (硼砂与硼酸)、pH 5 (乙酸盐)、pH 7和8 (磷酸盐)、pH 10和11 (碳酸氢钠与氢氧化钠)、pH 12 (磷酸盐与氢氧化钠)，分别配制的3 mL丝素蛋白溶液，加入450 μL的1 mg/ mL京尼平溶液，80 ℃条件下反应2 h后测定A590 nm值，并以1 mg/ mL丝素蛋白溶液为参比，进行紫外与可见光吸收光谱(200~800 nm)扫描.
1.4 荧光光谱测定
向两试管中加入1 mg/ mL的丝素蛋白PBS (pH 8.0)溶液3 mL， 然后分别加入PBS (pH 8.0)和1mg/ mL的京尼平溶液450 μL，在35 ℃条件下反应，取2 min、0.5、3、6、24、48 h的反应产物，用PBS (pH 8.0)稀释4倍后在35 ℃条件下进行荧光光谱测定，测定采用Hitachi Fluorescence Spectrctrctrophotometer F-4500记录300~700 nm的荧光发射光谱，激发光波长为280 nm [15]，数据导出后利用Origin 7.5作图分析.
1.5 溶液反应产物的稳定性分析
京尼平与丝素蛋白溶液(京尼平与丝素蛋白质量比为15%)在80 ℃水浴条件下反应达到稳定后，于室温条件下密闭放置1 mo后测定A590 nm值；自然光强条件下放置，每隔1 h测定一次至6 h；或进行光照处理，处理时光照条件(光源：1 000 W卤化物灯，光强：5 000 lx)，持续照射6 h，每隔1 h测定一次A590 nm值，求出A/A0 (A表示测定时光吸收值，A0为最初光吸收值)值，利用Origin 7.5作图分析.
2 结果与分析
2.1 蚕丝在京尼平溶液中浸泡染色
蚕丝浸泡于无色的0.1%京尼平溶液中，于80 ℃条件下2 h蚕丝会染成蓝色，晾干后呈蓝黑色(图1) . 实验过程中发现，蚕丝染上颜色的快慢与京尼平溶液的浓度及pH相关，在0.2%京尼平溶液中快于0.1%京尼平溶液中，在PBS (pH 8.0)溶液中快于水溶液(pH 5.5)中. 晾干染色蚕丝的深浅也显示与京尼平溶液的浓度及pH相关，使用水溶液的显紫黑色，使用PBS (pH 8.0) 溶液的显青黑色.
2.2 京尼平与丝素蛋白溶液的颜色反应
以蚕丝为原料，制备丝素蛋白溶液，进一步在液体状态下，分析京尼平对无色的丝素蛋白的染色过程与影响因素. 采用两种温度(35 ℃和80 ℃)与两种pH (pH 5.5和pH 8.0)条件，发现其他条件相同时，温度对京尼平染色丝素蛋白有显著影响，35 ℃时反应48 h的溶液颜色较浅，而80 ℃时反应2 h的溶液颜色较深，这存在典型的温度效应，表明发生了化学反应(图2). 反应体系的pH影响生成产物的颜色，pH 5.5时为蓝色而pH 8.0时为蓝紫色. 此结果表明不同温度和pH条件下，反应进行程度和反应产物的颜色不同.
2.3 京尼平与丝素蛋白溶液反应产物的吸收光谱与荧光光谱分析
利用紫外可见光光谱扫描，检测京尼平与丝素蛋白溶液反应过程中体系吸收光谱变化. 未反应前，京尼平水溶液只在242 nm处具有最大特征光吸收值，而丝素蛋白水溶液在230 nm处具有肽键的吸收峰，280 nm处具有典型的蛋白质吸收峰，可见光区均无吸收. 京尼平水溶液与丝素蛋白水溶液混合后在35 ℃条件下反应. 反应初期，290 nm及380 nm处出现了新的吸收峰，推测可能是反应的中间产物，随后原来各自的紫外吸收峰降低，而在590 nm附近出现一个新的特征光吸收峰，这与溶液呈现为蓝紫色相吻合(图3). 并且随着反应时间的延长，590 nm吸收峰不断增高，A590 nm值不断增大，说明所生成的颜色产物的最大特征光吸收值在590 nm附近. 文献曾报道，京尼平与氨基酸反应后生成的栀子蓝色素的特征光吸收峰也在590 nm附近[16].
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