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1引言
随着人们对健康环保纺织品需求的增加以及各国政府对环境保护强制力度的加大,在纺织印染行业中一种新型的纺织助剂———生物酶制剂的应用逐渐发展起来。目前,一种基于果胶酶的新型纺织生物助剂正在应用推广中,它主要用于棉、麻的前处理工艺。由于纺织企业多数对果胶酶的生物特性不甚了解,在工艺应用过程中缺乏相应的检测手段,使其推广受到限制。酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量的重要指标,因此,建立适用于纺织行业的果胶酶酶活检测方法,是十分迫切和必要的。
2果胶酶的酶促作用机理
果胶酶是一类复合酶,是指分解果胶质的多种酶的总称。我们测定的酶活值通常是这一类复合酶协同作用的综合结果。果胶酶可分为两大类:解聚酶和果胶酯酶。解聚酶主要是通过水解作用和反式消去作用,切断果胶和果胶酶分子α-1,4糖苷键,将果胶分子降解为小分子。果胶酯酶的作用是使果胶分子中的甲酯水解,最后形成果胶酸。
果胶质主要是由Ｄ-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接形成的直链状聚合物。部分Ｄ-半乳糖醛酸上的羧基被甲醇酯化、形成甲酯,或被一种或多种碱部分或全部中和。果胶质在植物的细胞组织中起着“粘合”作用,在棉纤维的初生胞壁中,果胶质含量约占9%,而麻纤维则更高。
通过果胶酶的作用,将果胶质降解为小分子物质,从纤维中游离出来,可使与其粘合在一起的其它杂质(如蜡质、蛋白质、灰份等)与纤维素彻底分开,达到棉精炼或麻脱胶的目的。
对于纺织行业,需要的是将果胶催化水解成可游离出纤维的、小分子物质的果胶酶活性(力),因此,主要测定解聚酶的活力。解聚酶对果胶分子的酶促催化作用表现为,每切断一个果胶分子的α-1,4糖苷键,就会形成一个还原性醛基。通过测定这些还原性醛基生成的量,即可判定解聚酶的酶活力。
3测定酶活力(性)的基本原理
酶作为一种生物催化剂,其酶活力值是与其催化效率及有效(即有生物活性)酶的含量相关的。酶活力是酶在单位时间内将底物转化为反应产物的
根据酶促反应动力学的米氏学说,从酶被底物饱和的现象出发,按照“稳态平衡”假说的设想,可推导出如下公式:
产物生成速率=ｋ3[总酶][底物]/([底物]+ｋｍ)(1)
式中:[总酶]———酶的总浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);
[底物]———底物浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);
ｋ3———在酶促反应的第二步,形成最终产物的速率常数;
ｋｍ———米氏常数(ｍｏｌ/ｍＬ),其值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。
要估计[总酶],首先要固定所有可控制的独立变量,如ｐＨ值、温度等。
当[底物]>>Ｋｍ时,底物对反应速率的影响可忽略(酶饱和),酶促反应达到最大反应速率Ｖｍａｘ,其结果是:
产物生成速率=ｋ3[总酶]=Ｖｍａｘ=Ｕ
Ｕ就成为总酶量的一种测量。因此,可以通过测定Ｕ来反映酶制剂中有效酶蛋白的含量。
4果胶酶酶活的测定方法概述和比较
测定果胶酶酶活的方法有很多,但基本上都是利用酶促分解果胶产生的粘度下降或生成的还原性醛基来测定果胶酶酶活。这些方法概括起来主要有粘度降低法、滴定法和分光光度法3种。本文分别选取一种较典型的测定方法加以介绍。
4.1粘度降低法
4.1.1原理
果胶溶于水后形成粘稠状溶液,其粘度和溶解度与其聚合和酯化程度有关。可以利用果胶的这种性质,测其酶活力。即在一定温度、酶浓度下和一定反应时间内,测定标准果胶溶液粘度的降低率。
4.1.2操作方法
浴中保温10ｍｉｎ后,加入1ｍＬ酶液,继续保温,在不同时间分别测定反应混合液流出粘度计小球的时间。对照实验采用经热处理已失活的酶液。
4.1.3计算
粘度下降百分数可用下式表示:
粘度
式中:Ｔ、Ｔｏ和Ｔα分别为反应混合液、对照混合液和缓冲液的流出时间(ｓ)。
酶溶液要预先稀释,使粘度降低范围在20%～80%。在此范围内,酶浓度对数与粘度降低率成正比。以酶作用时间为横坐标、粘度下降百分数为纵坐标做标准曲线,在图中查出粘度下降50%时对应酶的作用时间(Ｔ1/2)。在上述条件下,引起粘度下降50%的酶量为10个果胶酶活力单位,即酶活单位=10/(Ｔ1/2/3600)。
4.2滴定法
4.2.1原理
果胶酶彻底水解果胶,生成半乳糖醛酸;半乳糖醛酸可与碘(过量)反应。反应后剩余的碘可用硫代硫酸钠溶液滴定,据此可得出酶解反应产生的半乳糖醛酸的量。以生成半乳糖醛酸的量衡量果胶酶的活力。
4.2.2测定方法
取1%果胶溶液10ｍＬ,加入到5ｍＬ酶液和5ｍＬ水,调ｐＨ至3.5,在50℃水浴中保持2ｈ,取出加热煮沸。冷却后,取5ｍＬ反应液移入碘量瓶中,加1Ｍ碳酸钠溶液1ｍＬ,0.1Ｎ碘液5ｍＬ,摇匀,加塞,于室温下放置20ｍｉｎ,加2Ｎ硫酸2ｍＬ,用0.05Ｎ硫代硫酸钠滴定至淡黄色,加0.5%淀粉指示剂1ｍＬ,继续滴定至蓝色消失为止。记录所消耗的硫代硫酸钠毫升数Ａ。空白试验用10ｍＬ果胶溶液、10ｍＬ水,不加酶液,不经保温,直接取此混合物5ｍＬ于100ｍＬ三角瓶中用于滴定,记录消耗的硫代硫酸钠毫升数Ｂ。
4.2.3计算
在上述条件下,1ｈ酶促转化果胶、生成1ｍｇ当量游离半乳糖醛酸所需的酶量定为一个酶活单位。
每毫升酶液的活力单位=(Ｂ-Ａ)Ｎ×0.51×20.(5×2×5)(3)
式中:Ｎ———硫代硫酸钠的当量浓度;
0.51———1ｍｇ当量硫代硫酸钠相当于0.51ｍｇ当量的半乳糖醛酸;
20———分解果胶反应液的总体积数;
5、2、5———分别表示反应中加入酶液的毫升数、反应时间、滴定时所取反应液的毫升数。
4.3分光光度法
4.3.1原理
果胶酶分解
4.3.2操作方法
取0.5%果胶溶液0.5ｍＬ加入到0.5ｍＬ酶液中,摇匀。在50℃水浴中准确反应0.5ｈ,取出后,迅速在沸水浴中加热5ｍｉｎ,冷却。取0.5ｍＬ反应液移入加有0.5ｍＬＤＮＳ试剂的试管,加4ｍＬ蒸馏水,摇匀,在沸水浴中加热5ｍｉｎ,迅速冷却。用分光光度计在540ｎｍ处测其吸光度值。参比液配制:加热灭活5ｍｉｎ的0.5ｍＬ的稀释酶液与0.5ｍＬ0.5%果胶溶液充分混合。
4.3.3计算
采用标准曲线法,配制一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液,在540ｎｍ处测定吸光度(Ａ),以葡萄糖浓度(Ｃ)为横坐标、吸光度(Ａ)为纵光标作Ａ.Ｃ标准曲线(参见5.2节图2)。由标准曲线可得公式:
Ａ=斜率×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)(4)
未知试液测定吸光度值Ａ后,可通过上式求得Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)。
在上述条件下,每小时内每毫升果胶酶酶促转化果胶生成1ｍｇ当量还原糖(以半乳糖醛酸计)所需的酶量定义为一个酶活单位。即:
果胶酶活(ｍｇ半乳糖醛酸/ｍＬ·ｈ)=酶液稀释倍数×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)×2×194/180(5)
式中:194/180———葡萄糖换算成半乳糖醛酸的量;
2———测定中稀酶液被0.5%果胶溶液稀释的倍数。
4.43种方法的比较
将粘度降低法用来测定果胶酶的复合酶活力比较准确,但操作过程也相对复杂,且测定灵敏度不高。滴定法设备使用简单,测试重现行好,准确度高,但测定时间长,过程较繁琐,试剂用量较大。而分光光度法测定的灵敏度、准确度均高,重现性好,试剂用量少,尤其是操作省时、简便。对于上述3种测定方法,根据纺织行业的特点,笔者认为分光光度法更适于纺织工作者应用。下面重点探
5应用ＤＮＳ比色法测定果胶酶酶活
5.1果胶溶液的配制以及酶液的稀释
果胶溶液的配制浓度以及酶液的稀释倍数是相互联系的两个数据,它们的确定对酶活测定结果的正确性起着关键作用。通过完成以下试验,可以确定有关参数条件。
5.1.1材料与方法
5.1.1.1仪器与试剂
ＵＶ—9200分光光度计;果胶(Ｓｉｇｍａ)、果胶酶制剂(ＮＯＶＯ)、3,5-二硝基水杨酸、巴比妥酸、巴比妥钠。
5.1.1.2溶液配制
ＤＮＳ试剂:将6.3ｇ3,5-二硝基水杨酸、262ｍＬ2ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ加到500ｍＬ含182ｇ酒石酸钠的热水溶液中,再加5ｇ苯酚及5ｇ亚硫酸钠,待溶解、冷却后,加蒸馏水定容至1000ｍＬ,贮于棕色瓶中,一周后即可使用。
5.1.1.3配制巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6)
称取1.84ｇ巴比妥酸,置于56～60℃水中溶化,然后加入10.3ｇ巴比妥钠,加蒸馏水定容至1000ｍＬ。
5.1.1.4配制0.5%果胶溶液
准确称取0.5ｇ果胶于烧杯中,用巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6)溶解、稀释定容至100ｍＬ。
5.1.2制作果胶酶稀释倍数与吸光度关系曲线
分别按表1的稀释倍数用蒸馏水稀释果胶酶,将稀释酶液按4.3.2测定吸光度值,以果胶酶稀释倍数的倒数为横坐标,吸光度(Ａ)为纵坐标作关系曲线(见图1)。
