2·1·2 流动相的确定 考察了分别采用甲醇-磷酸盐(图1A)和甲醇-Tris缓冲液为流动相(图1B)时的分离效果。结果表明, 2种缓冲溶液的分离效果相当,混合芳香胺得到很好的分离。对于2, 6-二甲基苯胺和2, 4-二甲基苯胺(图1中13、14号峰),采用磷酸盐缓冲液的分离效果明显优于Tris缓冲溶液。因此本实验选择甲醇-磷酸盐缓冲溶液为流动相。
2·1·3 定容溶剂的选择 许多芳香胺存在同分异构体,如:邻甲苯胺与对甲苯胺、对氯苯胺与间氯苯胺、2, 4-二甲基苯胺与2, 6二甲基苯胺、1-萘胺与2-萘胺等[18]。采用单一的GC-MS或HPLCDAD方法时,对于某些同分异构体的芳香胺不能准确定性,因此经常需要同时采用2种色谱检测手段。在原SN/T 1045·1-2002标准中,最后一步操作须将提取的芳香胺用二氯甲烷从水相萃取后,将二氯甲烷转移出,再氮气吹干,甲醇溶液定容,步骤繁琐,极易造成损失。本实验最后一步加入甲基叔丁醚作为定容介质,以满足处理后的样品在HPLC和GC -MS上同时进样的要求。实际在HPLC上对分别以甲基叔丁醚和甲醇为溶剂配制的芳香胺标准品进行分离,比较发现甲基叔丁醚溶剂标准品中2, 4-二氨基甲苯和2, 4-二氨基苯甲醚(图2, 1、2号峰)峰形尖锐,分离效果明显优于甲醇溶剂标准品,但是2, 6-二甲基苯胺和2, 4-二甲基苯胺(图2, 13、14号峰)无法分离。其余峰的分离情况二者无显著差异。综合考虑, HPLC进样前,在进样瓶中将甲基叔丁醚溶剂吹干替换为甲醇溶剂。为保证氮气吹干过程中不损失或尽量减少待测物质的损失,吹干前先加入微量1 mol/L盐酸与待测芳香胺成盐,吹干后再用等量1 mol/L氢氧化钠与生成的盐反应将芳香胺释放出。
2·2 前处理条件的优化
2·2·1 提取溶剂的优化 SN/T 1045·1-2002标准中以乙醚为提取溶剂。乙醚在使用前需要除去过氧化物并进行重蒸馏,且乙醚的沸点低,在蒸馏过程中易爆。本实验将乙醚改为甲基叔丁醚,大大提高了实验的安全性,简化了实验步骤,同时加标回收实验结果表明,待测芳香胺的提取效率不受影响。
2·2·2 净化试剂的优化 将SN/T 1045·1-2002标准中净化试剂十一钨硅酸钾改为十一钨硅酸钠。由于钠盐比钾盐的可溶性强,不易析出晶体,因此更便于保存,可以有效延长试剂的使用周期。比较了分别以十一钨硅酸钾和十一钨硅酸钠为净化试剂,采用本方法在30 mg/L水平进行加标回收实验。对实验结果进行t检验(95%置信区间,自由度为2),得到23种芳香胺的t值均小于t0·05,2(t0·05, 2=4·30),表明钠盐和钾盐的净化效果无显著性差异。
比较了以新配制的Na盐和1个月前配制的Na盐为净化试剂,本方法在30 mg/L水平进行3次加标回收实验,经t检验(95%置信区间,自由度为2), 23种芳香胺的t值均小于t0·05,2(t0·05, 2=4·30),表明二者无显著性差异。此外,还对1个月内3个不同时间配制的钠盐样品进行了紫外光谱分析,结果表明三者的特征吸收一致,十一钨硅酸钠稳定无变化,有效期为30d。
2·3 回收率与精密度实验
以pH 6·0的柠檬酸盐缓冲溶液模拟人体的汗液环境,分别加入7·5、15、30mg/L 3个水平的芳香胺标准品进行回收实验,每一水平分别做6个平行样品,相对标准偏差和平均回收率数据见表1。
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