摘要目的：建立百合中总生物碱的含量测定方法。方法：采用酸性染料比色法测定总生物碱含量。以秋水仙碱为对照品，溴甲酚绿为酸性染料，在pH3.6缓冲溶液条件下，用氯仿萃取，于414nm波长处测定其吸光度，并测定了4个产区的百合中总生物碱的含量。结果：秋水仙碱在120~200μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为A=0.0019C+0.0014（r=0.9997）；秋水仙碱的平均加样回收率为（101.8±1.59）%，RSD=1.57%（n=6）。结论：所建立的总生物碱测定方法简便、准确，为百合质量的控制提供实验依据。
关键词：百合 总生物碱 酸性染料比色法
中药百合为百合科植物卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）、百合（Lilium brownii F.E.Brownii var.viridulum Baker）或细叶百合（Lilium pumilum DC.）的干燥肉质鳞叶，味甘、寒，归心、肺经，具有养阴润肺、清心安神之功效[1]。现代医药学研究证实，百合除了具有镇咳、平喘、祛痰、助眠、抗疲劳、耐缺氧等功效外，还具有较好的抗肿瘤活性，其抗肿瘤的主要活性成分为生物碱类成分[2]，包括秋水仙碱，以及与秋水仙碱结构相似的卓酚酮类生物碱。但目前尚未有其含量测定的研究，因此有必要对百合中所含的总生物碱进行含量测定。本研究采用酸性染料比色法，以秋水仙碱为对照品，建立了百合中主要成分总生物碱的含量测定方法，并对江苏宜兴、甘肃兰州、浙江湖州、湖南龙山四大产区百合中的总生物碱进行了含量测定，为更好地控制百合质量，使其充分发挥抗肿瘤药效提供实验依据。
1·仪器、试剂与材料
UV-2802型紫外可见分光光度计（龙尼柯上海仪器有限公司）；METTLER TOLEDO分析天平、十万分之一分析天平、METTLER TOLEDO 320 pH计（METTLER TOLEDO分析仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（金坛市双捷实验仪器厂）。秋水仙碱对照品（纯度>99%，购于中国药品生物制品检定所）；百合药材，均购于安徽亳州药材有限公司（产地：湖南龙山20110523，甘肃兰州20110523，经鉴定为百合科植物百合；江苏宜兴20100809，浙江湖州20110523，经鉴定为为百合科植物卷丹），其余试剂均为分析纯。 醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.6）：取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20mL，再加水稀释至250mL，即得[1]。 0.05%溴甲酚绿酸性染料的配制：精密称取溴甲酚绿0.05g，加pH3.6醋酸-醋酸钠溶液溶解至100mL，摇匀，即得。
2·方法与结果
2.1对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的秋水仙碱对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用pH 3.6醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.2mg/mL的秋水仙碱对照液。
2.2供试品溶液的制备精密称取百合粉末1.0g置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加入pH 3.6醋酸-醋酸钠缓冲液50mL，加热回流提取1h，离心，抽滤，滤液减压浓缩后，定容至25mL，即得供试品溶液。
2.3测定波长的选择精密吸取秋水仙碱对照液与百合供试品溶液各3mL，置于分液漏斗中，分别精密加入溴甲酚绿5mL，再加入氯仿10mL，振摇3min，静置30min，分取氯仿层，并加入0.5g无水硫酸钠，放置0.5h。另取醋酸-醋酸钠缓冲液3mL，同法操作，所得氯仿液为随行空白液。分别在400～700nm波长范围内进行扫描。结果表明，秋水仙碱对照液和百合供试品溶液在414nm处均有最大吸收，故选择414nm为检测波长。
2.4标准曲线的制备精密吸取秋水仙碱对照液0.0、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、3.0mL，置于分液漏斗中，再分别补加3.0、2.1、1.8、1.5、1.2、0.9、0.6、0.0mL醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 3.6），精密加入溴甲酚绿5mL，再分别加入氯仿10mL，振摇3min，静置30min，分取氯仿层，并加入0.5g无水硫酸钠，放置0.5h。以醋酸-醋酸钠缓冲液3mL为随行空白对照，于414nm处依法测定吸光度。以秋水仙碱对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0.0019C+0.0014（r=0.9997），结果表明，秋水仙碱的质量浓度在120~200μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.5精密度试验精密量取0.2mg/mL秋水仙碱对照液3.0mL，置于分液漏斗中，参照“2.4”项下方法操作，于414nm处依法测定吸光度，连续测定6次。结果RSD=0.79%，说明仪器所测数据准确可靠。
2.6重复性试验精密称取湖南龙山百合（批号：20110523）粉末6份，各1.0g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液3.0mL，置于分液漏斗中，按“2.4”项下方法操作，于414nm处依法测定吸光度，计算其平均含量为0.627%，RSD为0.84%。结果表明，该方法重现性良好。
2.7稳定性试验精密吸取“2.2”项下制备的供试品溶液3.0mL，按“2.4”项下方法操作，显色后分别在0、5、10、20、30、40、50min于414nm处依法测定其吸光度。RSD为0.56%，表明其在50min内稳定。
2.8加样回收率试验精密吸取6份已知浓度的供试品溶液各1.5mL，分别精密加入1.5mL秋水仙碱对照品溶液（浓度为0.250mg/mL），混匀，比色测定吸光度。根据回归方程计算回收率。秋水仙碱的回收率为（101.8±1.59）%（n=6），结果见表1。
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