1.2.4红外光谱的测定
将浓缩至浑浊的色素溶液高速离心，去上清液后置于烘箱中60℃烘干，取少量色素粉末于红外灯下烘干后加入适量溴化钾混匀压片，测其红外吸收光谱。
1.2.5高效液相色谱分离
将稀释后的棕色棉色素和白色棉棉籽壳色素水溶液按如下色谱条件进行分离:柱温30℃，流速1mL/min，进样量20μL，检测波长280nm。流动相为乙腈(A相)和0.5%的甲酸水溶液(B相)，采用梯度洗脱，流动相配比为:0～10min，80%～50%A;10～20min，50%～30%A;25min，30%A。
2结果与分析
2.1色素化学成分的初步鉴定
显色反应是鉴定天然产物的主要方法之一。观察样品与诊断试剂反应后的颜色及是否产生沉淀即可推测出样品的化学成分。天然棕色棉色素和白色棉棉籽壳色素的化学试剂显色反应结果如表1所示。天然棕色棉色素和白色棉棉籽壳色素与盐酸镁粉、醋酸镁、硼氢化钠、硼酸的反应均为阴性，结合图1中的紫外光谱特点，可以排除2种色素为黄酮类、二氢黄酮类、查尔酮类的可能性。与氯化铝无反应，说明2种色素不具有典型的蒽醌类结构。与三氯化铁反应均呈墨绿色，与醋酸铅反应均有棕色沉淀生成，说明2种色素都是含有邻二酚羟基的多酚类化合物。向2种色素滴加pH=4的明胶水溶液，色素溶液立即变浑浊，放置12h后均有肉色沉淀生成;2种色素与浓硫酸反应均有红棕色沉淀生成;向点在硅胶板上的2种色素喷洒1%FeCl3溶液，色素斑点呈暗绿色，再经茴香醛硫酸溶液显色均为橙色，这些反应都呈现缩合单宁的特征。向色素的醋酸铅沉淀物滴加过量的醋酸，棕色棉色素大部分溶解，白色棉棉籽壳色素沉淀物全部溶解，这也符合缩合单宁类的反应特点。向点在滤纸上的2种色素喷洒盐酸香草醛溶液，白色棉棉籽壳色素斑点呈现粉红色，而棕色棉色素斑点略带红色，表明前者主要成分含有间苯三酚结构，后者含该结构的成分含量很低。2种色素与菲林试剂反应均有少量砖红色沉淀生成，表明2种色素中某些含量较低的成分含有葡萄糖糖苷。
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2.2色素的紫外可见光谱分析
缩合单宁是羟基黄烷类化合物以碳—碳键相联缩合而成，具有C6—C3—C6的结构，各单体内及单体间的苯环之间并未形成共轭结构。缩合单宁前体黄烷醇类本身无色，在植物体内相关酶的作用下氧化缩合而显浅黄至暗红棕色，缩合程度越高，其颜色也越深。天然棕色棉色素与白色棉棉籽壳色素的紫外可见光谱如图1所示。图中显示2种色素都有2个吸收峰，均为芳环的特征吸收带，天然棕色棉色素和白色棉棉籽壳色素的E2带分别为200nm和204nm，B带分别为275nm和280nm。黄烷醇类单宁除了在200nm左右有1个E带吸收峰外，在280nm左右还有1个中等强度的B带吸收峰。相关文献记载，黑荆树皮单宁(主要成分为低聚原花色素)的分光光度定量测定波长为203nm和280nm，其紫外光谱特点与棕色棉色素和白色棉棉籽壳色素十分相似。结合2种色素的显色反应和紫外光谱特点，确定棕色棉色素和白色棉棉籽壳色为同一类物质，即缩合单宁类化合物。
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多酚类化合物由于酚羟基的存在，加入相应的诊断试剂后，UV-VIS光谱会发生变化，这种性质可用于判断化合物的结构及羟基所在的位置。诊断试剂一般为弱碱或金属盐，加入弱碱可使酚羟基离解形成负氧离子，增大共轭系统的电子云密度，使紫外光谱红移，酸的存在会缓解酚羟基的离解，从而使紫外光谱红移幅度减小。由于酚羟基被氧化成共轭羰基，缩合单宁氧化成的醌类物质的紫外光谱在弱碱的作用下不会产生以上变化。加入诊断试剂后棕色棉色素的紫外光谱变化情况如图2所示。由图可知，棕色棉色素的E2带和B带吸收峰分别在200nm和275nm处，加入醋酸钠后吸收带分别红移至203nm和279nm，而向色素水溶液中滴加醋酸钠/硼酸后测得的2个吸收带分别位于203nm和276nm处。对比向色素溶液滴加醋酸钠后扫描的结果，红移幅度减小。诊断结果表明色素分子苯环上的酚羟基是存在的，棕色棉色素主要成分不是缩合单宁氧化成的醌类物质。相关著作记载，植物体内的单宁类化合物是不稳定的，在氧气和多酚氧化酶的作用下会被氧化成苯醌类化合物，苯醌类化合物也很不稳定，容易被其他物质中的氢还原，特别是具有邻二酚羟基结构的单宁类，被氧化成邻苯醌后，遇到自身的氧化前体(或含氢的溶剂)可在短时间内被还原。若邻二酚羟基处于B环上，氧化而成的邻苯醌与自身的氧化前体反应时，除了被还原成前体外，还有对苯醌生成。对苯醌较稳定，不易被还原成酚类，所以，棕色棉色素的主要成分是缩合单宁类，可能含有少量的缩合单宁氧化而成的苯醌类化合物。
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2.3色素的红外吸收光谱分析
纯化后天然棕色棉色素与白色棉棉籽壳色素的红外光谱如图3所示。由图可知:天然棕色棉色素与白色棉棉籽壳色素在3395cm－1处均有强而宽的羟基伸缩振动吸收峰，2920、2850cm－1为甲基或亚甲基的对称与非对称伸缩振动带，这说明2种色素的某些成分含有糖苷。1620、1451cm－1处为棕色棉色素芳香骨架的振动吸收带，1123cm－1处为苯环上C—O的伸缩振动吸收峰，1384cm－1处为酚羟基的面内弯曲振动峰。与棕色棉色素不同，白色棉棉籽壳色素芳香骨架的振动吸收带位于1608、1510、1450cm－1处，而1270、1073cm－1处为芳香醚(Ar—O—C)的振动吸收带。2种色素分别在1708、1697cm－1处有吸收强度较弱的非共轭羰基吸收峰。这是由于含羰基的组分在色素混合物中所占比例较少。IR波谱特点也符合2种色素是缩合单宁类的论断。
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