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一种微生物降解苯环的酶活测试方法

来源:印染在线 发布时间:2012年01月04日

2.2以对苯二甲酸为唯一碳源,杆菌F4降解对苯二甲酸的酶活

待测酶活的菌悬液的催化条件,需要加入3g/L磷酸二氢钾和7g/L的磷酸氢二钠作缓冲溶液,维持体系稳定的pH值=6.8,采用该缓冲溶液配制1g/L的对苯二甲酸溶液。

将底物溶液灭菌后,加热到37℃,将离心后的菌体悬浮在灭菌后的溶液中,混合均匀后,在37℃,200r/min下振荡反应,并开始计时,经过30min后,取出反应液,迅速95℃水浴灭活5min,检测底物变化:

 

将上述反应前后的反应液稀释50倍,使之在所述线性方程的浓度范围之内。稀释后的溶液在240nm波长下,测试反应前后的吸光度分别为1.607和1.472。根据线性方程计算反应前后对苯二甲酸的浓度分别为1.004g/L和0.915g/L;将所得对苯二甲酸的浓度值代入酶活公式(1)中,酶活U=△C/M/△t×103,其中,M为166.13,△t为30,即得到该菌悬液的酶活为:U=0.018。

2.3补加酵母粉为有机氮源,杆菌F4降解对苯二甲酸的酶活

在催化反应液中加入酵母粉作有机氮源可有效催进微生物对碳源的消耗速率,从而提高酶活。为了确定酶活的提高程度,向反应液中加入1g/L的酵母浸出粉,同时加入3g/L磷酸二氢钾和7g/L的磷酸氢二钠作缓冲溶液,维持体系稳定的pH值=6.8,最后加入对苯二甲酸,配成1g/L的溶液。

将底物溶液灭菌后加热到37℃,将离心后的菌体悬浮在灭菌后的溶液中,混合均匀后,在37℃,200r/min振荡反应,并开始计时。经过30min后,取出反应液,迅速95℃水浴灭活5min,检测底物变化。

将上述反应前后的反应液稀释50倍,使之在线性方程的浓度范围之内。稀释后的溶液在240nm波长下测试反应前后吸光度分别为1.607和1.341。根据线性方程计算反应前后对苯二甲酸浓度分别为1.004g/L和0.829g/L。

代入公式(1),酶活U=△C/M/△t×103,(其中M为166.13,△t为30)得到菌悬液酶活为:U=0.035。与2.2中结果比较发现,加入酵母粉可将菌悬液的酶活提高将近1倍。

2.4以原儿茶酸为唯一碳源,细菌TJ降解原儿茶酸的酶活

待测酶活的菌悬液的催化条件需要加入4g/L磷酸二氢钾和6g/L的磷酸氢二钠作缓冲溶液,维持体系稳定的pH值为7左右,因此,采用缓冲溶液配制2g/L的原儿茶酸溶液。

将底物溶液灭菌后加热到37℃,将离心后的菌体悬浮在灭菌后的溶液中,混合均匀后,在37℃,200r/min振荡反应,并开始计时。经过30min后,取出反应液,迅速95℃水浴灭活5min,检测底物变化。

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