双波长分光光度法测定x、y组分体系中X组分的浓度是从Y组分的吸收光谱曲线上选出具有相同吸光度的两个波长，波长λ2(通常为测定波长)和波长λ1(参比波长)进行波长组合。因此，波长组合 λ1和λ2的选取是方法的关键。
对双组分混合体系，所选择的波长组合λ1、λ2必须符合两个必要条件：(1)在这两个波长处，共存组分应具有相同的吸光度(等吸光度点)，即△A=0；(2)在这两个波长处，待测组分的吸光度差值△A应足够大。波长组合λ1、λ2的选择一般采用双波长等吸光度点作图法选定。以测定x．y两组分混合体系中X组分为例，选择x的最大吸收波长λ2为测定波长，从此点作波长轴的垂线，与Y的吸收光谱曲线交于一点，过此点作波长轴的平行线，与y的吸收光谱曲线相交于另外一点，即为等吸光度点。以此作为参比波长λ1，用此波长组合测定x、Y混合体系中X组分的含量时，测得的△A值与Y组分浓度无关。如果有多个等吸光度点，则应选择△A值较大，且波长差较小的两波长组合，以提高测量的精密度。此外，测定波长也不一定在待测组分的最大吸收处，只要满足△A足够大即可。
1．2．2 应用实例
范雪荣等对同时测定组合浆料中PVA和淀粉含量的双波长分光光度法进行了研究。参考PVA(10 m/L)和淀粉(80 mg／L)的吸收光谱曲线及双波长等吸光度点作图法，选取λ2= 624 nm，λ1=500 nm为测定混合组分中PVA的参比波长。
显色体系的选择：硼酸介质：40 g硼酸溶于1 L 水中，碘-碘化钾溶液：升华过的碘l2．7 g及25 g 碘化钾溶于蒸馏水中，稀释至1 L。
硼酸浓度对吸光度的影响：在其他条件不变的情况下，4％硼酸用量在6．00 mL～20．00 mL范围内，淀粉与碘形成的络合物的吸光度基本不变，而 PVA与碘形成的络合物的吸光度开始逐渐上升。
硼酸用量在l2．00 mL-20．00 mL范围内，吸光度基本上不变。实验选用4％ 硼酸溶液l5．00 mL。
碘用量对吸光度的影响：碘溶液用量在2．00 mL～4．00 mL范围内时，PVA与碘形成络合物的吸光度变化甚小，实验选用2．00 mL碘-碘化钾溶液。
参考PVA和淀粉吸收光谱图及双波长等吸光度点作图法，选取λ2=624／nm作为测定混合组分中 PVA的测定波长，选定参比波长λ1=500 nm。
于奕峰等 对双波长分光光度法测定退浆废水中聚乙烯醇和淀粉浓度进行了研究。
显色体系的选择：硼酸介质：24．72 g硼酸溶于 1 L水中，碘-碘化钾溶液：升华过的碘12．7 g及25 g碘化钾溶于蒸馏水中，稀释至1 L。
硼酸浓度对吸光度的影响：实验结果表明，在其它条件不变的情况下，硼酸用量在5．00 mL～2O．00mL范围内，淀粉与碘形成的络合物的吸光度基本不变，而PVA与碘形成的络合物的吸光度逐渐上升，但硼酸量大时，PVA极易絮凝析出，故选择硼酸用量为5．00 mL较佳。
碘用量对吸光度的影响：碘溶液用量在2．00 mL～4．00 mL范围内时，PVA和淀粉与碘形成的络合物的吸光度变化甚小，但碘溶液用量的增加使最大吸收波长紫移，综合考虑选择碘用量为2．00 mL 为宜。
参考PVA和淀粉吸收光谱图及双波长等吸光度点作图法，选取λ2=660 nm作为测定混合组分中 PVA的测定波长，选定参比波长λ1=500 nm。表2列出了两位研究者应用双波长分光光度测量的操作条件及测量范围。
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