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酶制剂的酸性蛋白酶活力的测定

来源:印染在线 发布时间:2009年06月19日

1.1原理福林试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等),它使蛋白质及其水解产物呈上述反应,利用这个原理可以测定蛋白酶活力的强弱。以酪蛋白为作用底物,在一定pH值和温度下,同酶液反应,经一段时间后加入三氯乙酸,终止酶的反应,并使残余的酪蛋白质沉淀,同水解产物分开。经过滤后取过滤液(含蛋白质水解产物的三氯乙酸溶液),用Na2C03碱化,再加入福林试剂使之发色。蓝色反应的强弱与过滤波中蛋白水解产物的量成正比例,而水解产物的量又同酶活力成正比。因此,根据蓝色反应的强弱可以计算出蛋白酶的活力。1.2操作方法1.2.1 试剂1.2.1.l福林试剂于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(NaMoO4·2H2O)25g。水700ml,85%的磷酸50ml,浓盐酸100ml,文火回流10h,加入硫酸锂(Li2SO4)150g,蒸馏水50ml,混匀取去冷凝器,加入几滴液体溴,再蒸沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色。若溶液有绿色,需再加数滴液溴,再蒸沸除去,冷却后定容至1000ml,过滤,置于棕色瓶中保存,此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。1.2.1.2 0.4mol/l的TCA溶液称取三氯乙酸65.4g,加水定容至1000ml。1.2.1.3 0.8mol/l的碳酸钠溶液称取无水碳酸钠84.8g,加水溶解,定容至1000ml。1.2.1.4 pH值为3.6的醋酸缓冲液称取NaAc·3H20 16g与268ml浓度为6mol/l的醋酸溶液混合,稀释定容至1000ml。1.2.1.5 2%酪蛋白溶液称取干酪索20g,加入0.lmol/l的氢氧化钠20ml,在水浴中加热溶解,然后用pH值为3.6的醋酸缓冲液定容至10

00ml。该试剂配制后应及时使用,或放入冰箱内保存。1.2.1.6 100μg/ml酪氨酸溶液精确称取在105℃供箱中烘干至值恒重的酪氨酸0.1g,逐步加入0.lmol/l的盐酸,使之溶解,加蒸馏水定容至1000ml。该试剂配制后也应及时使用,或放入冰箱内保存。1.2.2 绘制标准曲线配制浓度分别为(单位:μg/ml):0、20、40、60、80、100的酪氨酸溶液,各取lml(做4个平行样),加入不同的试管中,再各加入已稀释的福林试剂lml和0.4mol/l的碳酸钠5ml,摇匀,置于水浴锅中,40℃保温发色20min。然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm,以浓度为0μg/ml的酪氨酸反应液做空白对照)。1.2.3 样品酶活的测定

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