摘要：采用海藻酸钙包埋法固定活性黑5高效脱色菌，通过正交试验确定固定化的最优条件，考察了pH、温度、初始染料浓度和重复利用次数等因素对固定化菌体脱色特性的影响，同时通过投加固定化颗粒处理模拟染料废水研究其生物强化作用。结果表明，最优固定化条件为海藻酸钠浓度3%，CaCl2浓度2%，菌体量与包埋剂量之比2：1；固定化颗粒对染料脱色的最适pH为8左右，最适温度为30℃，具有耐低温、染料浓度耐受极限高和可重复利用等特性，但在强碱性、高温和重复利用多次后，其机械强度降低；固定化菌体对以葡萄糖为外加碳源的染料废水的脱色效果较好，且浓度以1 g/L为宜，在厌氧污泥反应器中投加固定化颗粒对染料去除效率有所提高。
关键词：高效脱色菌；固定化；脱色特性
随着纺织工业的迅速发展，染料的使用量和纺织印染废水的产生量也在成比例增长。其中，偶氮染料由于具有较好的牢度性能而成为工业中染料用量最大的一类，广泛应用于纺织、皮革、食品、化妆品等行业[1]，其产量占染料总量的70%左右[2]。偶氮染料在生物处理中依靠厌氧微生物产生的偶氮还原酶使其偶氮键断裂，产生苯胺类小分子物质，进而通过后续好氧处理使苯胺类物质得到进一步降解[3]。近年来，许多研究者[4-6]已成功筛选出对部分偶氮染料具有高效脱色能力的菌种，并对其进行鉴定及脱色特性的研究。
微生物固定化技术是产生于20世纪80年代的一种新型生物技术，可将微生物封闭在天然高分子多糖类或合成高分子凝胶中，从而使微生物固定化，具有细胞密度高、活性强、耐毒能力强、可反复利用等优点[7]，近年来开始广泛应用于难生物降解废水的处理中。同时，通过向废水生物处理系统中投加从自然界中筛选出来的固定化优势菌种可以达到提高系统对目标物质的处理能力，改善污泥性能，增强系统稳定性，耐负荷冲击等目的，也有利于在反应器内保持较高的菌种浓度和较易实现固液分离。大量研究表明[8-10]，经固定化技术处理的优势菌种投加到印染及染料废水的处理系统中可以实现生物强化作用，且在一定程度上避免了菌种流失及同化等现象。
1·材料与方法
1.1材料
菌种：肠杆菌S8（Enterobactor sp.S8），由实验室处理染料废水的厌氧反应器中的污泥经筛选后分离纯化得到，其对偶氮染料活性黑5在25 h内的脱色率可达到85%以上[11]。
染料：活性黑5（活性黑KN-B），最大吸收波长λmax=600 nm。
培养基：富集培养基（g/L）：KH2PO4 1.8，Na2HPO·412H2O 3.5，MgSO·47H2O 0.2，FeCl·36H2O，蛋白胨2.0，牛肉膏3.0，葡萄糖4.0，pH 7.5；脱色培养基：在富集培养基中加入一定浓度的染料活性黑5。
染料废水组分（mg/L）：NaHCO3 125，KCl 4.7，无水CaCl2 2.5，NH4Cl 45，KH2PO4 24，MgSO4·7H2O27.5，染料50，一定量葡萄糖。
1.2菌悬液的制备
将-20℃保存的菌种接入富集培养基扩大培养12 h，培养后的菌液于8 000 r/min离心10 min，弃去上清液，取离心管底部菌体用无菌水制成菌悬液。
1.3固定化颗粒的制备
配制一定比例的海藻酸钠溶液，在加热条件下待完全溶解后，与菌体按一定比例混匀。在液面上方10 cm处用注射器将混合液匀速滴入一定浓度的CaCl2溶液中，形成直径约5 mm左右的小球，将固定化颗粒浸没在CaCl2溶液中放入4℃冰箱继续固化20 h。用无菌水冲洗数次后收集，储存于4℃冰箱中备用。
1.4脱色体系的建立
将5 mL海藻酸钠包埋菌体后制备的海藻酸钙小球加入到100 mL含有一定浓度染料的脱色培养基中，放入恒温培养箱中静置脱色。
1.5脱色率的测定
菌株对偶氮染料的脱色能力用脱色率表示，其测定采用比色法。将经过菌株脱色后的反应液于8 000r/min的条件下离心10 min，取上清液在最大吸收波长处测定其吸光度A1，再测定不接菌的含相同浓度染料的反应液的吸光度A0。
2·结果与讨论
2.1固定化条件的正交试验
在脱色菌由海藻酸钙包埋固定的过程中，包埋剂海藻酸钠浓度、交联剂CaCl2浓度、菌体量与包埋剂量之比等诸多因素都会对固定化菌体的脱色能力产生一定影响。因此，为优化固定化条件，设计了“三因素三水平”正交试验，并以固定化颗粒对活性黑5的脱色率为指标确定最优条件。
根据表1中不同因素和水平制备9组固定化颗粒，以5 mL海藻酸钠包埋制备的固定化颗粒为一单位量，投加到装有100 mL脱色培养基的250 mL三角烧瓶中，染料浓度为50 mg/L，置于30℃生化培养箱中静置脱色30 h后，测定吸光度并计算脱色率，结果如表1所示。
经过正交试验分析可知，海藻酸钠包埋法制备固定化颗粒的最优条件为海藻酸钠浓度3%，CaCl2浓度2%，菌体量与包埋剂量之比2：1。
2.2 pH对活性黑5脱色的影响
配制染料浓度为50 mg/L的脱色培养基，调节脱色培养基pH分别为5、6、7、8、9、10，分别投加一单位量经最优条件制备的固定化颗粒，并设置投加自由菌体的对照组，于30℃静置脱色30 h，pH对脱色率的影响如图1所示。
从图1中可知，固定化菌体和自由菌体对活性黑5脱色的最适pH范围有很大差异。固定化菌体在中性和碱性条件下使染料具有较高脱色率，且随着pH增大脱色率也随之增大，但逐渐趋于稳定状态，可达到90%左右；自由菌体则在酸性偏中性的条件下具有较高的脱色能力，且最适的pH范围较小。从固定化颗粒的外观分析，随着pH增大，固定化颗粒的溶胀现象也随之增大，使小球的机械强度降低，增大传质系数，从而导致小球破裂甚至解体，溶出一定量的有机物质和菌体，使脱色菌S8与染料更好的接触，增大脱色率，当pH大于9时，这种固定化颗粒破裂并溶出菌体的现象较为明显，使脱色液呈现一定浊度。同时，当pH为5和6时，经脱色后的固定化小球呈深蓝色，说明小球在酸性条件下具有一定的吸附作用。因此，固定化菌体比自由菌体具有更宽的最适pH范围，且更适于染料及印染废水的偏碱性。
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