摘要：通过设计正交试验，分别对影响肉座菌(Hypocreasp)Z28生长与产纤维素酶的4个因子进行了研究。结果表明：在偏酸性，生长60h，高C/N的条件下，Z28长势最好；在优化条件下，CMCase活力为69.8U/mL，FPA活力为22.0U/mL，Β-葡萄糖苷酶活力为15.2U/mL。

引言

利用微生物产生的纤维素酶将纤维素糖化，再经发酵转化成燃料乙醇，不仅可以充分利用生物质资源．更重要的是可以缓解化石能源短缺带来的全球性能源危机。

产纤维素酶的微生物主要是真菌中的木霉和曲霉，但这类菌的最大缺点就是Β-葡萄糖苷酶的产量和活力很低．而且对葡萄糖的耐受性也很差。在纤维素分解过程中，由葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶转化生成的纤维二糖若不能被一葡萄糖苷酶及时地转化为葡萄糖，就很容易形成产物积累．在浓度较高时就会抑制纤维素酶的合成。这也是利用木霉等真菌菌株工业化生产纤维素酶产量或酶活偏低、生产成本偏高的主要原因。

本实验室保藏的Z28是一株纤维素酶高产菌，是一株罕见的肉座菌(Hypocreasp．)，其Β-葡萄糖苷酶活力相当高。本研究对Z28的最佳生长及产纤维素酶的液体发酵工艺进行了研究，以期为将来的工业化推广应用提供理论依据。

1试验内容

1．1试验材料

菌种Z28由本实验室保藏；pNPG(对硝基酚一B—D一葡萄糖苷)购自Sigma公司；Whatmanl号定性滤纸购自广州捷倍思生物科技有限公司：绿色木霉(Trichodemaviride)AS3．2774和AS3．3002由中科院微生物所菌种保藏中心提供。

1．2试验用培养基

生长培养基：20g葡萄糖，2g(NH4)2S04，2gKH2P04，0．3gMgSO4·7H20，0．3gCaC12，5mgFeS O4.H2O，1．6mgMnSO4，1．7mgZnC12，l000mL水。

种子培养基(P

产酶培养基：2gKH2PO4，2．5g(NH4)2S04，0-3gM04·7H20，0．3gCaC12，5mgFeSO4·7H2O，1．6mgMnSO4，1．7mgZnC12，1．7mgCOC12，lmLTween一20，2g稻秆和麦秆，l000mL水。

1.3试验方法

1.3.1细菌干重的测定

将菌体培养液过滤后得到的菌丝置于80℃烘箱中烘干至恒重后称取质量。

1．3．2玎维豢的制箭

将在PDA上培养3d的种子液按2％的接种量接种到产酶培养基上，在温度为30℃，转速为160r/min的条件下发酵5d，离心发酵液，取其上清液作为试验酶液。
1．3．3纡维系的测定

CMC酶活的测定：取适当稀释酶液0．5mL，加入2％的CMC—Na溶液lmL(以pH=5．0，0．2mol/L醋酸缓冲液配制)，在50℃恒温水浴中反应30min．用DNS法测定还原糖量。

滤纸酶活(FPA)测定：取适当稀释酶液0．5mL，加入pH=5．0，0．2mol/L醋酸缓冲液lmL，再加入Whatmanl号定性滤纸l条(6cmxlcm，约50mg)，在50℃恒温水浴中反应60min，用DNS法测定还原糖量。

Β-葡萄糖苷酶酶活测定：取适当稀释酶液0．5mL，加入pH=5．0，0．2mol/L醋酸缓冲液1．5mL，再加入2mmo~L的pNPG溶液(用pH=5．0，0．2mol/L的醋酸缓冲液配制)4mL，在50℃恒温水浴中反应10min。加入0．5mol/LNa2CO3溶液4mL，终止反应后在分光光度计上于400nm处检测生成的对硝基酚量。

酶单位：把lmL酶液每小时产生1umol底物(以葡萄糖或对硝基酚计)的酶量定义为1个活力单位(U/mL)。

2 Z28生长正交试验

2．1试验设计

碳源(A)、氮源(B)、pH值(C)和时

2 2 试验结果与分析

试验结果见表2 。

由表2可知，在A3B1C1D2条件下，Z28生长最好。影响Z28生长因子的主次顺序：碳源>时间>氮源>pH值。碳源是影响Z28生长的最重要因素，继续提高碳含量，降低氮含量(提高C/N)，更有利于Z28的生长；偏酸性的pH值对Z28生长影响不大，这说明适于Z28生长的pH值较广，有利于工业应用。

3 Z28产酶正交试验

3．1试验设计

碳源(A)、供氧量(B)、时间(C)和表面活性剂(D)对真菌产纤维素酶能力有重要影响。碳源为不同比例的稻秆粉与麦秆粉的混合物，供氧量以装液量来衡量。每个因子选择3个水平进行产纤维素酶正交试验(表3)。

3．2试验结果

根据表3选择适当因子的水平组合，进行9组试验。结果见表4。

3．3试验分析

采用极差分析法处理正交试验数据。结果见图1和表5。在A1B1C2D1条件下。Z28产纤维素酶能力最强，继续减少表面活性剂。增加供氧量可提高Z28纤维素酶各组分的活力。各个因子对纤维素酶各组分诱导能力不同。对CMCase。FPA和Β-葡萄糖苷酶的具体影响有所差异。

影响CMCase活力的因子的主次顺序：时间>表面活性剂=碳源>供氧量。各因子显著性均较高，各因子水平尚有较大的提高幅度：影响FPA活力的因子的主次顺序：时间>供氧量>碳源>表面活性剂，除时间外，其它因子的显著性都不高；影响Β-葡萄糖苷酶活力的因子的主次顺序：供氧量>时间>表面活性剂>碳源。各因子显著性均较低。各因子水平可以提高的幅度不大，这是目前真菌产生的Β-葡萄糖苷酶产量和活力偏低的原因之一。继续提高碳源中稻草粉含量能大幅度提高CMCase活力，Β-

4与其它菌比较

将Z28，绿色木霉AS3．2774，AS3．3002在产酶培养基上进行液体发酵。测量其产生的纤维素酶的活力(表6)。从表6可以看出，Z28产生的纤维素酶的活力(尤其是Β-葡萄糖苷酶的活力)明显高于绿色木霉AS3．2774和AS3．3002

5结论

在本试验中。各个因子对CMCase．FPA和Β-葡萄糖苷酶活力的影响不同，说明不同的因子对纤维素酶各组分的诱导能力是不同的。据报道，对纤维素酶诱导效力最强的是槐糖。但其价格昂贵。本试验以廉价的秸秆作为底物和诱导物。具有较好的应用效果。在本试验最佳工艺条件下，CMCase活力为69．8U/mL。FPA活力为22．0U/mL，Β-葡萄糖苷酶活力为l5．2U/mL。

Β-葡萄糖苷酶能否高效分解中间产物纤维二糖一直是制约纤维素高效降解的关键因素之一四。本实验室的Z28产生的Β-葡萄糖苷酶活力高，可以和其它纤维素酶高产菌组合发酵嘲，降低葡萄糖和纤维二糖对酶活的抑制度，提高纤维素的水解率，在工业上具有很大的应用潜力。